Studija koja pokazuje da je potrebno samo pet mutacija da bi se virus ptičjeg gripa H5N1 pretvorio u prenosilac vazduhom kod sisara – i koja je pokrenula istorijsku debatu o naučnoj odgovornosti i transparentnosti – objavljena je danas u časopisu Science , otkrivajući sve eksperimentalne detalje koje su mnogi stručnjaci nastojali da potisnu iz straha da bi njihovo objavljivanje moglo dovesti do širenja opasnog virusa.
U opširnom izveštaju, dr Ron Fuše iz Erazmus medicinskog centra u Holandiji i njegove kolege opisuju kako su koristili kombinaciju genetskog inženjeringa i serijske infekcije tvorova da bi stvorili mutirani virus H5N1 koji se može širiti među tvorovima bez direktnog kontakta.
Oni kažu da njihovi nalazi pokazuju da virusi H5N1 imaju potencijal da evoluiraju kod sisara i steknu prenosivost vazduhom, bez potrebe da se mešaju sa drugim virusima gripa kod posrednih domaćina kao što su svinje, i time predstavljaju rizik od pokretanja pandemije.
Fušeova studija je uparena sa drugom u kojoj je međunarodni tim koristio matematičko modeliranje kako bi došao do zaključka da, s obzirom na to koliko je malo mutacija potrebno da bi se stvorio virus koji se prenosi vazduhom, takav virus verovatno može evoluirati u prirodi, iako nije moguće kvantifikovati rizik. Napomenuli su da su dve od pet mutacija u virusu koji se prenosi vazduhom već uobičajene kod prirodnih H5N1 virusa.
„Sada znamo da živimo na liniji raseda“, rekao je juče na konferenciji za novinare časopisa „Sajens “ dr Derek DŽ. Smit sa Univerziteta u Kembridžu, glavni autor studije modeliranja . „To bi moglo nešto da uradi. Ono što treba da znamo je koliko je to verovatno.“
Druga od dve kontroverzne studije
Fušijeova studija je jedna od dva eksperimenta o prenosivosti H5N1 koji su izazvali žestoku kontroverzu počev od kraja prošle jeseni i druga je koja je objavljena. Prva studija, koju je vodio Jošihiro Kavaoka, doktor vetničarske medicine, doktor nauka, sa Univerziteta u Viskonsinu i Univerziteta u Tokiju, objavljena je u časopisu Nature početkom maja.
Kavaokin tim je koristio donekle drugačiji pristup da bi postigao isti cilj kao i Fuše. Kavaoka i kolege su uveli mutacije u gen hemaglutinina (HA) iz virusa H5N1, a zatim su ga kombinovali sa sedam gena iz virusa H1N1 iz 2009. godine, stvarajući hibridni virus koji se mogao širiti vazduhom između tvorova. Rekli su da je studija pokazala da se virus gripa sa H5 HA može širiti među sisarima - nešto što su prirodni H5N1 virusi izuzetno retko, ako uopšte i rade.
Kada se prošle jeseni pročula vest o studijama Fušea i Kavaoke, to je izazvalo zabrinutost zbog mogućnosti stvaranja i namernog ili nenamernog puštanja pandemijskog virusa. To je dovelo do preispitivanja od strane Nacionalnog naučnog savetodavnog odbora za biološku bezbednost (NSABB), koji savetuje Ministarstvo zdravlja i socijalnih službi.
Nakon dugog razmatranja, odbor je u decembru preporučio da se iz obe studije uklone ključni detalji pre objavljivanja, ali da se detalji podele sa odabranim naučnicima i zvaničnicima po principu „ko je to potrebno da znaju“.
Ali nakon što su autori – posebno Fuše – pružili neke dodatne informacije i pojašnjenja, odbor je 30. marta preporučio da se objave pune verzije obe studije, a federalni zdravstveni zvaničnici su podržali preporuku. NSABB je jednoglasno glasao za objavljivanje Kavaokine studije, ali je podeljen sa 12-6 oko Fušeove.
Žestoka kontroverza oko objavljivanja studija podstakla je grupu od 39 vodećih istraživača gripa, uključujući Fušea i Kavaoku, da uvedu dobrovoljni moratorijum na istraživanja osmišljena da povećaju prenosivost virusa H5N1 kod sisara. Moratorijum ostaje na snazi, čekajući dalji razvoj vladinih politika o biološkoj bezbednosti i biološkoj sigurnosti za takva istraživanja (videti povezanu vest CIDRAP-a ).
Kontroverza je takođe podstakla američku vladu u martu da iznese novu opštu politiku o postupanju sa „istraživanjima dvostruke upotrebe koja izazivaju zabrinutost“ ili DURC, što znači istraživanje koje bi moglo biti korišćeno i za dobro i za loše. Američki zvaničnici su ove nedelje rekli da će dodatni detalji o toj politici uskoro biti objavljeni u obliku nacrta smernica za institucionalne odbore za biološku bezbednost.
U listu pitanja i odgovora objavljenom uz Fušijeovu studiju, zvaničnici Erazmusa su rekli da je rad revidiran kako bi se bolje objasnili ciljevi istraživanja i koristi za javno zdravlje, i da su dodati „elementi za prikaz“ kako bi se objasnila virulencija i svojstva prenosa virusa koji se prenosi vazduhom, ali metode i rezultati nisu promenjeni. Takođe, rukopis je revidiran radi bolje jasnoće, jer se očekivalo da će privući širu čitalačku publiku nego što takvi izveštaji obično čine.
Što se tiče bezbednosti, eksperimenti su sprovedeni u laboratoriji za biološku bezbednost životinja nivoa 3 (ABSL3+) u Erazmusu, navodi se u izveštaju. Inspektori holandske vlade i američkih centara za kontrolu i prevenciju bolesti odobrili su objekte i procedure pre i tokom istraživanja. Istraživači su nosili zaštitnu opremu i ponuđene su im sezonske vakcine i vakcine protiv gripa H5N1.
Fušeov tim je počeo sa virusom H5N1
sakupljenim u Indoneziji i koristio je obrnutu genetiku da bi uveo mutacije za koje je u prethodnim istraživanjima pokazano da čine viruse H5N1 sličnijim ljudskim u načinu na koji se vezuju za ćelije disajnih puteva ili na druge načine. Virusi ptičjeg gripa više vole da se vezuju za alfa2,3-povezane receptore sijalinske kiseline na ćelijama, dok virusi ljudskog gripa više vole alfa2,6-povezane receptore. I kod ljudi i kod tvoreva, alfa2,6 receptori su dominantni u gornjim disajnim putevima, dok se alfa 2,6 receptori nalaze uglavnom u donjim disajnim putevima.
Promene aminokiselina koje je tim odabrao uključivale su N182K, Q222L i G224S, brojeve koji se odnose na pozicije u HA proteinu virusa, površinskom molekulu virusa koji se vezuje za ćelije domaćina. Q222L i G224S zajedno menjaju preferenciju vezivanja virusa gripa podtipa H2 i H3, promene koje su doprinele pandemijama gripa 1957. i 1968. godine, navodi se u izveštaju. A N182K je pronađen u ljudskom slučaju H5N1.
Naučnici su stvorili tri mutantna soja virusa H5N1 kako bi pokrenuli svoj eksperiment: jedan koji sadrži N182K, jedan sa Q222L i G2242, i jedan sa sve tri promene, objašnjava se u izveštaju. Zatim su pokrenuli svoju dugačku seriju eksperimenata sa tvorovima inokulacijom grupa od šest tvorova jednim od ova tri mutanta ili divljim tipom virusa H5N1. Analiza uzoraka tokom sedmodnevnog eksperimenta pokazala je da tvorovi zaraženi divljim tipom virusa izlučuju daleko više virusa od onih zaraženih mutantima.
U drugom koraku, tim je koristio mutaciju u drugom virusnom genu, PB2, proteinu polimeraznog kompleksa. Mutacija E627K u PB2 povezana je sa sticanjem sposobnosti virusa ptičjeg gripa da rastu u ljudskom respiratornom traktu, koji je hladniji od crevnog trakta ptica, gde virusi obično
Istraživači su otkrili da ova mutacija, kada je dodata dvema HA mutacijama (Q224L i G224S), nije proizvela virus koji snažnije raste kod tvorova, a virus se nije širio vazduhom sa zaraženih tvorova na neinficirane.
Korak pasiranja
Videvši da ovaj mutant nije uspeo da postigne prenos vazdušnim putem, istraživači su odlučili da „pasiraju“ ovaj soj kroz niz tvorova u nastojanju da ga primoraju da se prilagodi respiratornom traktu sisara – potez koji je Fuše nazvao „zaista, zaista glupim“, prema izveštaju o njegovom početnom opisu istraživanja na evropskom sastanku prošlog septembra.
Inokulirali su jednog tvora sojem sa tri mutacije, a drugog divljim tipom virusa i uzimali svakodnevne uzorke dok nisu eutanazirali životinje 4. dana i uzeli uzorke tkiva (nosne školjke i pluća). Materijal iz uzoraka tkiva je zatim korišćen za inokulaciju drugog para tvoreva, a ovaj korak je sproveden šest puta. Za poslednje četiri pasaže, naučnici su koristili uzorke ispiranja nosa umesto uzoraka tkiva, u nastojanju da sakupe viruse koji su izlučeni iz gornjih disajnih puteva.
Količina mutantnog virusa pronađena u uzorcima nosnih školjki i briseva nosa povećavala se sa brojem pasaža, što signalizira da je virus povećavao svoj kapacitet za rast u gornjim disajnim putevima tvora. Nasuprot tome, virusni titri u uzorcima od tvoreva zaraženih divljim tipom virusa ostali su isti.
Sledeći korak je bio testiranje da li virusi proizvedeni pasiranjem mogu da se prenesu vazduhom. Četiri tvora su inokulirana uzorcima mutantnog virusa „pasaž-10“, a dva tvora su inokulirana divljim sojem „pasaž-10“. Neinficirani tvorovi su smešteni u kaveze pored zaraženih, ali ne dovoljno blizu za direktan kontakt.
Tvorovi izloženi onima sa divljim virusom ostali su nezaraženi, ali tri od četiri tvora smeštena blizu onih koji su nosili mutirani virus jesu se zarazila, otkrili su istraživači. Dalje, uzeli su uzorak od jednog od „primalaca“ tvora i koristili ga za inokulaciju drugog tvora, koji je zatim preneo virus na još dva tvora koja su smeštena blizu njega.
Tako je ukupno šest tvoreva zaraženo mutantnim virusom putem prenosa vazduhom. Međutim, nivo širenja virusa ukazivao je na to da se virus vazduhom nije prenosio tako efikasno kao virus H1N1 iz 2009. godine.
Tokom eksperimenata prenosa virusa vazdušnim putem, tvorovi su pokazivali znake bolesti, uključujući letargiju, gubitak apetita i načupano krzno. Jedan od direktno inokuliranih tvorova je uginuo, ali svi koji su zaraženi virusima koji se prenose vazdušnim putem su preživeli.
Kada su naučnici sekvencionirali genome virusa koji se šire vazduhom, pronašli su samo dve zamene aminokiselina, obe u HA, koje su se pojavile kod svih šest virusa: H103Y i T156A. Primetili su nekoliko drugih mutacija, ali nijednu koja se pojavila kod svih šest virusa koji se šire vazduhom.
„Zajedno, ovi rezultati ukazuju na to da čak pet supstitucija aminokiselina (četiri u HA i jedna u PB2) može biti dovoljno da se virus H5N1 [visoko patogenog ptičjeg gripa] prenosi vazdušnim putem“, napisali su istraživači.
U daljim koracima, istraživači su inokulirali šest tvorova visokim dozama virusa koji se prenosi vazduhom; nakon 3 dana, tvorovi su bili ili mrtvi ili „na samrti“. „Intratrahealne inokulacije u tako visokim dozama ne predstavljaju prirodni put infekcije i generalno se koriste samo za testiranje sposobnosti virusa da izazovu upalu pluća“, navodi se u izveštaju.
Istraživači su otkrili da ova mutacija, kada je dodata dvema HA mutacijama (Q224L i G224S), nije proizvela virus koji snažnije raste kod tvorova, a virus se nije širio vazduhom sa zaraženih tvorova na neinficirane.
Mutantni virus osetljiv na antivirusni lek
Tim je takođe utvrdio da je virus koji se prenosi vazduhom osetljiv na antivirusni lek oseltamivir (Tamiflu), baš kao što su obično prirodni H5N1 virusi.
Pored toga, procenili su da li bi postojeća vakcina protiv H5N1 verovatno pružila bilo kakvu zaštitu od virusa. Generisali su hibridni virus koji se sastoji od mutantnih gena HA i PB2 kombinovanih sa šest gena iz virusa adaptiranog na miševe, nazvanog PR8. Ovaj hibrid je dobro reagovao sa antitelima koje je generisalo nekoliko postojećih vakcina protiv H5N1, što sugeriše da bi vakcine mogle da pruže izvesnu zaštitu.
Konačno, tim je testirao da li antitela kod starijih osoba (starijih od 70 godina) mogu prepoznati hibridni virus PR8/H5. Odgovor je bio ne, što sugeriše da bi imali mali imunitet na njega ili na mutant koji se prenosi vazduhom.
Naučnici napominju da su supstitucije Q222L i G224S, koje su povezane sa promenama u preferenciji vezivanja, pronađene kod ptičjih H2 i H3 virusa u prirodi, mada ne i kod H5N1 virusa.
Ostale tri mutacije koje su dosledno pronađene kod mutanta koji se prenosi vazduhom pronađene su i kod prirodnih H5N1 virusa, što ukazuje na to da one ne narušavaju virusnu „sposobnost“. H103Y je identifikovan samo jednom, ali je E627K u PB2 pronađen u oko 27% ptičjih H5N1 sekvenci i oko 29% ljudskih H5N1 sekvenci, navodi se u izveštaju. Takođe, Q222L je jedna od četiri ključne mutacije identifikovane u studiji Kavaoka.
„S obzirom na veliki broj domaćina zaraženih virusom HPAI A/H5N1 širom sveta, visoku stopu virusnih mutacija i očigledan nedostatak štetnih efekata na sposobnost mutacija koje dovode do prenosa vazdušnim putem, možda je samo pitanje slučaja i vremena pre nego što se pojavi virus A/H5N1 koji se prenosi sa čoveka na čoveka“, navode naučnici.
Studija modeliranja ukazuje na moguću pretnju
U pratećoj studiji modeliranja, istraživači iz Kembridža pokušali su da procene rizik da se virus koji se prenosi vazduhom, poput Fušeovog, može prirodno razviti. Analizirajući podatke nadzora tokom proteklih 15 godina, primetili su da su dve od uključenih mutacija (T156A i E627K) uobičajene kod prirodnih izolata H5N1, a određeni broj izolata je imao obe promene.
Istraživači su razvili matematički model kako se virusi repliciraju i evoluiraju kod sisara i procenili su šanse da se tri dodatne potrebne mutacije razviju kod jednog domaćina ili u kratkom lancu prenosa. Među faktorima koje su uključili bili su slučajna mutacija, produžene infekcije, prenos, imuni odgovor i štetne mutacije.
„Sa informacijama koje imamo, nemoguće je reći koliki je tačan rizik da se virus prenosi vazduhom među ljudima“, rekao je glavni autor Smit u saopštenju za štampu u Kembridžu. „Međutim, rezultati ukazuju na to da bi preostale tri mutacije mogle da evoluiraju kod jednog ljudskog domaćina, što virus koji evoluira u prirodi čini potencijalno ozbiljnom pretnjom.“
Autori preporučuju nekoliko strategija za dalja istraživanja, počevši od povećanog nadzora u regionima gde su identifikovane mutacije koje omogućavaju prenos vazdušnim putem. Debata se nastavlja
Prvi pokazatelji ukazuju na to da objavljivanje Fušeove studije neće okončati kontroverzu oko njenog objavljivanja i širi problem rešavanja istraživanja dvostruke namene.
Na jučerašnjoj konferenciji za novinare, dr Entoni Fauči, direktor Nacionalnog instituta za alergije i zarazne bolesti SAD, branio je objavljivanje svih detalja. „Mislim da koristi koje će proizaći iz Fušeovog rada u podsticanju razmišljanja i traženju načina za bolje razumevanje prenosivosti, adaptacije i patogenosti [H5N1] u mojoj glavi daleko nadmašuju rizik od zlonamerne upotrebe ovih informacija“, rekao je odgovarajući na pitanja.
„Kada nešto objavite u opštoj literaturi, podstičete razmišljanje i doprinos ljudi za koje na prvi pogled ne biste pomislili da bi ih to zanimalo“, dodao je. Rekao je da objavljivanje može pokrenuti uključivanje ljudi u širokom spektru disciplina, što može doneti koristi.
Međutim, neki stručnjaci za biološku bezbednost danas su izrazili sumnje.
Dr Erik S. Toner, viši saradnik u Centru za biološku bezbednost na Univerzitetskom medicinskom centru u Pitsburgu, komentarisao je putem e-pošte: „Mislim da publikacija povećava verovatnoću da će drugi želeti da repliciraju eksperimente i dalje nastave ovu liniju istraživanja. Što više laboratorija radi ova istraživanja, veća je verovatnoća da će slučajno bekstvo biti slučajno.“
„Jasno je da bi se smanjio rizik od slučajnog bekstva ako bi svi laboratorijski radnici bili efikasno vakcinisani protiv virusa. U radu se navodi da je laboratorijskim radnicima ponuđena vakcinacija protiv H5N1. Bilo bi lepo znati da li je to bilo potrebno i da li su radnici imali dobre titre antitela, kao i da je specifična vakcina protiv H5N1 pokazala efikasnost protiv istraživačkog soja.“
Toner je takođe rekao da nalazi snažno potkrepljuju zabrinutost da je moguća prirodno nastala pandemija H5N1. Ali je nazvao nalaze „samo umereno korisnim“ za praćenje gripa.
„Mnoge od mutacija koje su prijavili ranije su bile poznate kao zabrinjavajuće“, rekao je on. „Za ostale mutacije za koje se ranije nije sumnjalo da su povezane sa prenosom kod sisara, rad sugeriše da možda nisu važne pojedinačne mutacije, već različite kombinacije mutacija koje proizvode sličan rezultat. Poznavanje značaja svih mogućih kombinacija gotovo beskonačnog broja mogućih mutacija je izvan naših trenutnih mogućnosti.“
Dodao je da studija naglašava „hitnu potrebu za mnogo snažnijim globalnim nadzorom, uključujući mnogo više sekvenciranja i mnogo blagovremenije izveštavanje o podacima sekvenciranja. Takođe naglašava potrebu za globalnim akcionim planom zasnovanim na nadzoru. Drugim rečima, šta radimo što sada ne radimo ako pronađemo sve više dokaza o zabrinjavajućim mutacijama?“
Član NSABB-a koji se protivio objavljivanju pune verzije Fušeovog rada, danas je zadržao taj stav i izrazio zabrinutost zbog bezbednosnih rizika ako druge laboratorije širom sveta iskoriste nalaze za pokretanje sličnih studija.
Majkl T. Osterholm, doktor nauka, magistar javnog zdravlja, direktor Centra za istraživanje i politiku zaraznih bolesti Univerziteta u Minesoti, izdavač CIDRAP News-a, rekao je da podržava vrstu istraživanja koju su sproveli Fuše i Kavaoka i smatra da bi trebalo da se nastavi, ali ne u laboratorijama širom sveta.
Rekao je da studije Fušea i Kavaoke označavaju prvi put da su ljudi ikada probili barijeru između neprenosivosti i prenosivosti patogena kod životinja. Suština problema je prenosivost, a ne virulencija virusa dobijenih u laboratoriji, tvrdio je.
Šta bi virus H5N1, koji se prenosi sa tvora, uradio ljudima, nije poznato, prokomentarisao je on. „Ali ako počne da cirkuliše, kao što je slučaj kod svinja, sve opklade su otkazane. Kada se probi ta barijera prenosivosti, ovaj virus je otvoren za ozbiljne probleme.“
Detalji Fušijeove studije „trebalo je da budu objavljeni po principu „ko treba da zna“, rekao je Osterholm. „Mislim da smo se osvrnuli na ovo, nismo iscrpeli sve mogućnosti za objavljivanje.“ Mislio je na zaključak većine zvaničnika i naučnika koji su bili uključeni da nije bilo moguće brzo osmisliti način da se detalji podele samo sa odabranom grupom.
„Svima mnogo olakšavamo da ovo urade“, rekao je. „Šta ako neka kompanija za proizvodnju vakcina u zemlji u razvoju odluči da želi da sarađuje sa ovim i to izađe u javnost?“
On je prokomentarisao da se oslobađanje opasnog virusa gripa putem laboratorijske nesreće već jednom dogodilo, sa ponovnom pojavom virusa H1N1 1977. godine: „To je bio jasan slučaj virusa koji je procurio iz posla koji su Rusi radili.“
Osterholm je takođe upozorio da pitanja koja je pokrenuo Fušeov rad neće nestati, rekavši da će istraživački radovi koji su sada u pripremi izazvati još veću zabrinutost zbog moguće zloupotrebe i biološke bezbednosti.
„Mislim da su savezna vlada i NSABB u veoma lošoj poziciji da se nose sa budućim rukopisima koji su već u pripremi“, rekao je.
Još jedan član NSABB-a , dr Dejvid A. Relman sa Univerziteta Stanford, izrazio je stav da Fušeova studija nije trebalo ni da bude urađena, a kamoli objavljena.
„U osnovi, bio sam i još uvek sam protiv ovog konkretnog rada, jer su rizici nadmašili koristi, od samog početka, i još uvek jesu“, prokomentarisao je imejlom. „Ne verujem da su koristi, čak i ako bi se mogle ostvariti (npr. rano otkrivanje kod ptica i životinja) u bliskoj budućnosti, vredne značajnih rizika. Slučajno ispuštanje je velika briga, kao i zloćudno nepoštovanje javne bezbednosti.“
„Već znamo dovoljno da se maksimalno potrudimo za vakcinu protiv H5 virusa sa širokom zaštitnom efektom. Šta nam još treba? Da li zaista želimo da čekamo da se H5 virus, koji se prenosi respiratornim putem kod sisara, pojavi u prirodi? Čini se da je šira javnost uglavnom protiv ili barem veoma zabrinuta. Pravi moratorijum trebalo bi da se nastavi u doglednoj budućnosti.“
Pozitivniji pogled na istraživanje ponudio je Angus Nikol, CBE, šef Programa za grip u Evropskom centru za prevenciju i kontrolu bolesti.
Rekao je da je značajno to što su dva različita eksperimenta Fušea i Kavaoke proizvela viruse sa određenim stepenom prenosivosti vazduhom, što „sugeriše donekle veći rizik da se ovo desi u prirodi nego ako biste otkrili da postoji samo jedan način i jedan virus koji vas je doveo do ove faze. Međutim, mora se zapamtiti da su ovi virusi jedva prenosivi kod tvorova (Fuše je u Vašingtonu dao komentar da se ovi virusi zapravo nisu baš dobro širili prirodnim putem i da je njihova patogenost kod tvorova niža nego kod divljeg A(H5N1)“.
Nikol je dodao da je potrebno mnogo više istraživanja virusa: „Da li se rezultati mogu ponoviti od strane drugih? Na primer, da li su i dalje patogeni kod živine?... Zato je moratorijum na istraživanje nesrećan, iako je sasvim razumljiv s obzirom na snažna osećanja i zabrinutost. Nadam se da će na jesen biti postignut neki dogovor nakon šireg sastanka koji organizuje SZO [Svetska zdravstvena organizacija], što će omogućiti ponovno pokretanje pod neophodnim nivoom obuzdavanja.“
Takođe je prokomentarisao da su nalazi vredni za identifikovanje koje su mutacije u prirodi najzabrinjavajuće i za vođenje razvoja dijagnostičkih testova i vakcina protiv H5N1.
Herfst S, Schrauven EJA, Linster M, et al. Prenos virusa gripa A/H5N1 između tvorova vazdušnim putem.
Nauka 2012, 22. jun; 336 (rana onlajn publikacija) [ Pun tekst ]
Rasel K.A., Fonvil DŽ.M., Braun A.E.X. i dr. Potencijal evolucije virusa gripa A/H5N1, prenosivog kapljicama, u sisarskom domaćinu. Science 2012 Jun 22;336 (rana onlajn publikacija) [ Ceo tekst ]
Izvorv
Коментари
Постави коментар